描述：Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

组成与储存：

(1) BCA Reagent  100ml，室温保存；

(2) Cu Reagent  2.5ml，室温保存；

(3) BSA standard  4mg/ml  1ml，−20ºC冻存。1.5年有效。

可进行500次微板(microplate)测定或100次1ml比色杯测定。

所需设备：比色计、酶标仪、或微板比色仪，最佳工作波长562nm，可在540-590nm之间。

工作溶液(Working Reagent, WR)配制：将50体积BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即为WR工作试剂，呈嫩绿色，立即使用或者4℃保存不超过一天。

标准蛋白溶液配制：用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS、或与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释,得到BSA标准溶液80、40、20、10、5、2.5、1.25µg/ml。

蛋白测定

微量蛋白质浓度线性检测范围为1-100µg/ml。标准测定用1 cm光程玻璃或塑料比色皿，反应终体积1.2ml，用比色计测定。微板测定用96孔板，反应终体积240µl，用酶标仪、微板比色仪测定。

1. 标准测定：将0.2ml标准品或待测样本与0.8ml WR工作溶液混合。微板测定：将50µl标准品或待测样本与200µl WR工作溶液混合。

2. 37ºC反应30min；也可25ºC室温2小时或过夜。

3. 将反应管温度冷却至室温。测定562nm (可在540-590nm之间)光密度(OD)值。

4. 绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/ml或µg/ml)，Y轴为各标准管对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。