描述：Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的紫蓝色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

组成与储存：(500次)

(1) BCA Reagent 100ml，室温保存；

(2) Cu Reagent 2.5ml，室温保存；

(3) BSA standard 4mg/ml 1ml，−20ºC冻存。12个月有效。

所需设备：比色计、酶标仪或微板比色仪，最佳工作波长562nm，可在540-590nm之间。

工作溶液(Working Reagent, WR)配制：将50体积BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即为WR工作试剂，呈嫩绿色；室温1周内稳定。

标准蛋白溶液配制：用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS或与待测蛋白样品匹配的缓冲液进行倍比稀释: 20µl 4000µg/ml BSA + 30 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 50µl (BSA=1600 µg/ml)，从中取25 µl连续倍比稀释，得到BSA标准溶液1600、800、400、200、100、50、25 µg/ml，各25 µl。通常，样品蛋白浓度不会太高，也可以预先稀释待测样品，可以省略1600 µg/ml标准管而直接从800或1000 µg/ml开始，能节省标准蛋白用量。

蛋白浓度测定：

蛋白质浓度线性检测范围为10-2000 µg/ml。标准测定时，用1 cm光程玻璃或塑料比色皿，反应终体积1.1 ml，比色计测定。微板测定时，用96孔板，反应终体积225 µl，用酶标仪、微板比色仪测定。

1. 标准测定：将0.05~0.1 ml标准品或待测样本与1 ml WR工作溶液混合。微板测定：将25 µl标准品或待测样本与200 µl WR工作溶液混合。

2. 37ºC反应30min；也可25ºC室温2小时或过夜。60ºC 30 min反应可增加检测灵敏度至5-250µg/ml。

3. 将反应管冷却至室温。测定562 nm (可在540-590 nm之间)光密度(OD)值。

4. 绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/ml或µg/ml)，Y轴为各标准管对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。