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蛋白质定量试剂盒 (BCA法)
人阅读 发布时间:2022-05-25 08:51
描述:Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似,即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比,BCA蛋白测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的紫蓝色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
组成与储存:(500次)
(1) BCA Reagent 100ml,室温保存;
(2) Cu Reagent 2.5ml,室温保存;
(3) BSA standard 4mg/ml 1ml,−20ºC冻存。12个月有效。
所需设备:比色计、酶标仪或微板比色仪,最佳工作波长562nm,可在540-590nm之间。
工作溶液(Working Reagent, WR)配制:将50体积BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即为WR工作试剂,呈嫩绿色;室温1周内稳定。
标准蛋白溶液配制:用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS或与待测蛋白样品匹配的缓冲液进行倍比稀释: 20µl 4000µg/ml BSA + 30 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 50µl (BSA=1600 µg/ml),从中取25 µl连续倍比稀释,得到BSA标准溶液1600、800、400、200、100、50、25 µg/ml,各25 µl。通常,样品蛋白浓度不会太高,也可以预先稀释待测样品,可以省略1600 µg/ml标准管而直接从800或1000 µg/ml开始,能节省标准蛋白用量。
蛋白浓度测定:
蛋白质浓度线性检测范围为10-2000 µg/ml。标准测定时,用1 cm光程玻璃或塑料比色皿,反应终体积1.1 ml,比色计测定。微板测定时,用96孔板,反应终体积225 µl,用酶标仪、微板比色仪测定。
1. 标准测定:将0.05~0.1 ml标准品或待测样本与1 ml WR工作溶液混合。微板测定:将25 µl标准品或待测样本与200 µl WR工作溶液混合。
2. 37ºC反应30min;也可25ºC室温2小时或过夜。60ºC 30 min反应可增加检测灵敏度至5-250µg/ml。
3. 将反应管冷却至室温。测定562 nm (可在540-590 nm之间)光密度(OD)值。
4. 绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/ml或µg/ml),Y轴为各标准管对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。
组成与储存:(500次)
(1) BCA Reagent 100ml,室温保存;
(2) Cu Reagent 2.5ml,室温保存;
(3) BSA standard 4mg/ml 1ml,−20ºC冻存。12个月有效。
所需设备:比色计、酶标仪或微板比色仪,最佳工作波长562nm,可在540-590nm之间。
工作溶液(Working Reagent, WR)配制:将50体积BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即为WR工作试剂,呈嫩绿色;室温1周内稳定。
标准蛋白溶液配制:用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS或与待测蛋白样品匹配的缓冲液进行倍比稀释: 20µl 4000µg/ml BSA + 30 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 50µl (BSA=1600 µg/ml),从中取25 µl连续倍比稀释,得到BSA标准溶液1600、800、400、200、100、50、25 µg/ml,各25 µl。通常,样品蛋白浓度不会太高,也可以预先稀释待测样品,可以省略1600 µg/ml标准管而直接从800或1000 µg/ml开始,能节省标准蛋白用量。
蛋白浓度测定:
蛋白质浓度线性检测范围为10-2000 µg/ml。标准测定时,用1 cm光程玻璃或塑料比色皿,反应终体积1.1 ml,比色计测定。微板测定时,用96孔板,反应终体积225 µl,用酶标仪、微板比色仪测定。
1. 标准测定:将0.05~0.1 ml标准品或待测样本与1 ml WR工作溶液混合。微板测定:将25 µl标准品或待测样本与200 µl WR工作溶液混合。
2. 37ºC反应30min;也可25ºC室温2小时或过夜。60ºC 30 min反应可增加检测灵敏度至5-250µg/ml。
3. 将反应管冷却至室温。测定562 nm (可在540-590 nm之间)光密度(OD)值。
4. 绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/ml或µg/ml),Y轴为各标准管对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。