描述：

线粒体制备试剂盒 (Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。加入分离溶液，匀浆破碎组织细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。制备的线粒体具有很高的生物学活性，可进行各种功能研究如酶学测定，更可用于Western Blot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。

严格按照说明操作，总是能制备获得高纯度线粒体。一篇方法学研究论文发现，用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。

适用：

从组织、培养细胞制备高纯度线粒体，同时分离细胞胞浆成分。

组成：

Mito Solution  100ml for 50次制备；200ml for 100次制备

储存：

−20ºC 12个月有效

操作步骤：

以下所有操作均在4ºC进行

1.组织匀浆：100~200mg新鲜组织如肝、脑、肾、心肌等，剪为0.5cm2 碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5ml冰预冷的Mito

Solution。用间隙严紧的研杵上下研磨组织20次。

培养细胞匀浆：800×g 5min离心收集细胞。单次提取需2-5×107个细胞。加入1.5ml冰预冷Mito Solution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃

匀浆器内，用间隙严密的研杵研磨细胞30次。

2.将匀浆液转移到离心管中，800×g，4ºC离心5min。（胞核、膜碎片、未裂解细胞等在管底，弃去）

3.收集上清液并转移到新的离心管。再次800×g离心5min at 4ºC，弃沉淀。

4.将上清液转移到新的离心管。10,000×g离心10min 4 ºC。线粒体沉淀在管底。离心后的上清含胞浆成分，可收集用于对照实验。

5.洗涤线粒体：加入0.2ml Mito Solution，轻弹管底重悬线粒体沉淀；12,000×g离心10min 4ºC。弃上清，线粒体沉淀在管底。

6.重悬线粒体：可以用Mito Solution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀，具体用量是：约每100mg组织提取的

线粒体用50µl，约每5×107个细胞提取的线粒体用100µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调。

7.裂解线粒体后，进行蛋白浓度测定。立即使用或−70ºC保存。

说明：

1.制备高质量线粒体的关键：第一，全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中；第二，快速，微量制备比大规模制备操作更快速，更容易

获得完整的线粒体，且得率高；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。破碎效果与组织细胞类型有关；与组织块相

比，贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁。用1-3ml小容量玻璃匀浆器(而不是其它破碎装置)上下研磨培养细胞20-30次。玻璃匀浆器

须配套选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。正确的匀浆不是旋转研杵，而是上下缓慢推拉研

杵，研杵推进和提升过程中细胞遭受压力的剧变而破碎。研磨程度可用相差显微镜进行检查当未裂解细胞在~50%即可。过度研磨会破坏线粒体，而研

磨不足将降低线粒体得率。

2.如果不得不用电动匀浆器(polytron)，可选用6500转，刀头上下进出4次共计10秒。不同的电动匀浆器性能差别甚大，除非步步监测，否则分离结果

难以预料。

3.不同的离心机必须跟据离心力g计算正确的离心转速(允许10%波动)，否则将导致不纯。

4.进行Western Blot可直接用RIPA裂解液或SDS-PAGE样品缓冲液裂解线粒体；也可先用Mito Solution重悬线粒体，再加入2x SDS-PAGE样品缓冲液。

5.Cytochrome oxidase, Monoamine oxidase, Succinate dehydrogenas, Glutamate dehydrogenase可用作线粒体的标志酶。

6.重悬线粒体：可以用Mito Solution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀具体用量是：约每100mg组织提取的线

粒体用50µl，约每5×10^7个细胞提取的线粒体用100µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调。

7.裂解线粒体后，进行蛋白浓度测定。立即使用或−70ºC保存。